علائم اولیه هاری عبارتند از تب و اغلب درد به همراه گزگز ، خارش و سوزش ناحیه گزش و بیحسی ناحیه زخم می باشند. با گسترش ویروس در دستگاه عصبی مرکزی، التهاب کشنده و پیشرونده مغز و طناب نخاعی هم گسترش می یابد.

انواع روش های تشخیص هاری

• تشخیص بالینی
• یافته­ های تصویربرداری
• یافته­ های الکتروانسفالوگرافی
• جمع آوری نمونه های مختلف
• تشخیص آزمایشگاهی
• روش نمونه­ گیری مغز پس از مرگ
• تشخیص ­های افتراقی

تشخیص بالینی

تشخیص هاری در بیماران غیرایمن با وجود ترس از آب پس از گزش به وسیله­ی حیوان مبتلا یا مشکوک به هاری ساده است. البته در مناطقی که حیوانات اهلی ایمن شده­اند به این سادگی نیست. دوره نهفتگی بیماری بطور مشخص 1 تا 3 ماه است که ممکنست این مدت از کمتر از یک هفته تا بیش از یکسال بطول انجامد. طول دوره نهفتگی با توجه به محل ورود ویروس و مقدار بار ویروسی وارد شده به بدن متفاوت است. در طی دوره­ی کمون، هیچ روش تشخیصی وجود ندارد؛ لذا پس از هر گونه تماس با حیوان هار بایستی پیشگیری پس از تماس در اولین فرصت و حتی تا قبل از یروز علایم انجام شود. وقتی علایم شروع شد با آزمایشات استاندارد نمی­توان هاری را از سایر انسفالیت­ها  افتراق داد. مایع مغزی نخاعی ممکن است طبیعی باشد، اگرچه یک افزایش خفیف لنفوسیت­ها و افزایش متوسط پروتئین،  اغلب شرح داده شده است.

یافته­ های تصویربرداری

مطالعات سی تی اسکن مغز معمولا در هاری نرمال است، گرچه ضایعات کورتیکال با دانسیته کم و نیز ضایعات گانگلیون های قاعده  مغزی ممکنست دیده شود.

گزارشات مربوط به مطالعات MRI مغز مبتلایان به هاری، بیانگر یافته های طبیعی در مغز می باشند گرچه معمولا ضایعاتی در ماده خاکستری پارانشیم مغز درناحیه بصل النخاع ممکنست دیده شود.

یافته های MRI نشان دهنده عفونت مغزی بوده که علاوه بر مغز، در نخاع نیز، در هردو فرم بیماری هاری (فرم فلجی و فرم خشمگین) مشابه یکدیگر دیده می شوند.

یافته­ های الکتروانسفالوگرافی

الکتروانسفالوگرام ممکنست طبیعی بوده و یا تغییرات غیراختصاصی را در مغز انسان هار نشان دهد. فعالیت امواج آهسته و متناوب مغزی به همراه فعالیت اپی­لپسی (صرع) ممکنست دیده شود. یافته­های الکتروفیزیولوژیک مغزی نشان دهنده شواهدی دال بر گرفتاری اعصاب محیطی ویا سلولهای شاخ قدامی در برخی موارد بوده و در اشکال ازبین رفتن میلین اعصاب محیطی در موارد فلجی دیده شده است. نوروپاتی آکسونال اولیه در دو بیمار مبتلا به هاری فلجی دیده شده است.

جمع آوری نمونه های مختلف

تا قبل از انتقال و انجام نمونه ها، نمونه­ها بایستی در فریزر 80- درجه نگهداری شده و همراه با یخ خشک ارسال شوند. لازم به ذکر است کلیه آزمایشات تشخیصی قبل و بعد از مرگ، در بخش تحقیقات و مرکز رفرانس هاری WHO انستیتوپاستور ایران انجام می­شود (فرم­های ارسال و پاسخدهی: ضمیمه 2).

نمونه بزاق: از بیمار، با استفاده از دستکش و رعایت تمام موارد ایمنی، با استفاده از پیپت پاستور پلاستیکی سه نمونه­ی بزاق هرکدام به میزان 5/0 تا 1 میلی­لیتر به فاصله­ی زمانی 6-3 ساعت گرفته شود و درون یک ظرف کاملا دربسته تمیز بدون هیچ نگهدارنده­ای و با رعایت زنجیره­ی دمایی سرد به آزمایشگاه انتقال داده شود. آسپیراسیون تراشه و خلط برای آزمایش هاری مناسب نیست. آزمایشاتی که بروی این نمونه­ها، انجام می­شود، عبارتنداز: آزمایش تشخیص مولکولی به منظور تشخیص  RNA  ویروسی و کشت نمونه بزاق به منظور جداسازی ذرات عفونی ویروس.

نمونه بیوپسی پوست: یک نمونه نسبتاً ضخیم پوست به قطر 5 تا 6 میلیمتر بایستی از ناحیه خلفی گردن درقسمت حدفاصل رویش مو، گرفته شود. نمونه بیوپسی پوست بایستی حداقل حاوی 10 عددفولیکول مو با عمق مناسب باشد که شامل اعصاب پوستی در قاعده فولیکولها است.

طی نمونه برداری با پانچ نمونه استوانه ای به اندازه 8-5 میلیمتر بدست می آید که باید شامل لایه های اپیدرم ، درم و چربی زیرپوستی  subcutaneous باشد. برای نمونه­گیری با دست چپ پوست گردن را کشیده و با استفاده از پانچ نمونه گیری انجام می شود (لازم به توضیح است که جهت تشخیص پس از مرگ از نمونه­ی پوست گردن در صورت عدم امکان نمونه­برداری از مغز در شرایط خاص می­توان استفاده نمود).

شرایط ارسال نمونه: بیوپسی های تهیه شده را بایستی به روی یک قطعه کوچک گاز استریل مرطوب با سرم فیزیولوژی ( بدون آغشته بودن به محیط انتقال ویا رقیق کننده) گذارده و این مجموعه را درون یک ظرف انتقال کاملا دربسته قرارداد و طی 24 ساعت  و با حفظ زنجیره­ی دمای سرد (در صورت امکان cᵒ4) ارسال نمود. در صورتی که ارسال نمونه طول بکشد. نمونه باید در دمای cᵒ20- نگهداری و با یخ خشک ارسال گردد. انتقال نمونه از طریق بسته­بندی استاندارد سه محفظه­ای مورد تایید آزمایشگاه مرجع سلامت صورت پذیرد.

B لطفا روی هر نمونه اسم بیمار و نوع نمونه ذکر گردد.

تستهای قابل انجام برای این نمونه عبارتنداز: آزمایش ایمونوفلورسانس مستقیم، آزمایش تشخیص مولکولی و بررسی واریانت ویروسی.

شکل 10.1: پشت گردن (ناحیه مشکی) محل مناسبی برای بیوپسی پوست می­باشد.

.نمونه سرم و مایع مغزی – نخاعی: حداقل به میزان 5/0 میلی لیتر سرم و مایع مغزی – نخاعی برای آزمایش بایستی تهیه شود. چنانچه بیمار قبلا سابقه ایمونیزاسیون علیه هاری داشته باشد، بایستی نمونه سرمی دیگری نیز چند روز پس از اولین نمونه گیری از وی تهیه شود تا تیتر بالارونده  پادتن علیه هاری در وی مشخص گردد. تستهایی که روی این نمونه ها میتوان انجام داد عبارتنداز: آزمون ایمونوفلورسنت غیرمستقیم و تست ارزیابی خنثی سازی ویروس.

تشخیص آزمایشگاهی

حتی مقدار کمی از RNA ویروس هاری موجود در بزاق، بافت مغز و/یا مایع مغزی نخاعی[1] را می­توان با استفاده از RT-PCR تشخیص داد؛ این روش ثابت کرده است که یک ابزار تشخیصی ارزشمند برای این بیماری می­باشد. این روش، در ابتدا بر روی نمونه مایع مغزی نخاعی استفاده شد و پس از آن در بزاق برای تایید تشخیص بیماری هاری به کار رفت. برای آزمایش­های مولکولی، بزاق را می­توان با یک پیپت/قطره چکان استریل جمع­آوری نمود. در یک مطالعه، بر روی بزاق و CSF نه (9) نمونه از بیماران مبتلا به هاری تاییدشده، تشخیص premortem هاری انجام شد؛ RT-PCR  در پنج تن از نه نفر (56%) در بزاق و تنها در دو نفر (22%) در مایع مغزی نخاعی تایید شد. در مقایسه، بیوپسی پوست برای آنتی­ژن هاری ویروس با استفاده از روش فلورسنت-آنتی­بادی در شش نفر از هفت نفر (86 درصد) مثبت بود. این یافته­ها نشان داد که هر دو نمونه­ی بزاق و پوست جهت آزمایش تشخیص RNA ویروس هاری می­توانند مفید باشند.

از 20 مورد هاری انسانی تشخیص داده شده قبل از مرگ در ایالات متحده آمریکا بین سال­های 1980 و 1996 RNA ویروس هاری در بزاق 10 بیمار با روش RT-PCR تشخیص داده شد که این تعداد شامل سه نفری هم که ایزولاسیون ویروسی از بزاقشان منفی بود می­شد. باید تاکید کرد که نتیجه­ی منفی آنتی­ژن یا RNA هرگز احتمال بیماری هاری را به طور قطعی رد نمی­کند و اگر شک بالینی قوی است، این آزمون باید تکرار شود.

تشخیص قبل ازمرگ[2]، نیازمند چندین نمونه نظیر بزاق، بیوپسی پوست، نمونه مغزی نخاعی CSF و سرم می باشد، زیرا حساسیت یک نمونه منفرد گرفته شده ، محدود بوده و آزاد سازی ذرات ویروسی[3] بطور متناب صورت می گیرد.

• آزمایش های بیوشیمیایی و خون شناسی معمولا طبیعی بوده گرچه ممکنست کاهش سدیم خون بطور ثانویه ناشی از ترشح نامتناسب هورمون آنتی دیورتیک، دیده شود.
• آنالیز مایع مغزی نخاعی (CSF) معمولا در هاری انسانی غیر طبیعی است. افزایش تعداد گلبولهای سفید خون در 59% موارد، درهفته اول بیماری و در 87% ، بعداز هفته اول بیماری، در مایع مغزی نخاعی دیده می شود. شمارش گلبولهای سفید خون معمولا کمتر از 100 سلول. (بطورمیانگین 5 تا 3گلبول سفید) در هرمیکرولیتر مایع مغزی نخاعی بوده و اکثرگلبولهای سفید از نوع سلولهای تک هسته ای می باشند. غلظت پروتئین مایع مغزی نخاعی ممکنست، به میزان کمی افزایش یافته. و معمولا به کمتر از 100میلیگرم در صد و میزان گلوگز آن در محدوده طبیعی باشد بااینحال کاهش گلوگز مایع مغزی نخاعی، گاهگاهی گزارش شده است.
• پادتن خنثی کننده علیه ویروس هاری معمولا در بیماران غیرایمن، تا هفته دوم بیماری و یا حتی تا اواخر دوره بیماری در خون دیده نشود و ممکنست بیمار ، بدون داشتن سطح سرمی  پادتن ضدهاری قابل تشخیص درخون، از بیماری هاری فوت کند حساسیت مجموعه آزمایشات صورت گرفته فوق الذکر بستگی به کیفیت نمونه گرفته شده، زمان نمونه گیری و مهارت تشخیص دارد . بطور کلی، در بیماری که قبلا سابقه دریافت واکسن ویا سابقه دریافت سرم ایمونوگلوبولین هاری را نداشته است، تشخیص حضور  پادتن اختصاصی علیه هاری درسرم ، تایید کننده بیماری هاری است ولی در بیماری که قبلا واکسینه شده و مشکوک به هاری می باشد، بایستی نمونه دوم سرمی دیگری پس از چند روز از وی گرفته شده تا نشاندهنده تیتر بالارونده  پادتن و تایید هاری باشد، درغیر اینصورت ، تشخیص هاری منتفی می گردد.  پادتن ضد ویروس هاری در مایع مغزی نخاعی، پس از تشکیل در سرم ، ایجاد شده و معمولا تیتر کمتری نسبت به سرم دارد. تیترهای بسیار بالای  پادتن ضد ویروس هاری در مایع مغزی نخاعی به عنوان شواهدی دال بر انسفالیت ناشی از هاری در بیماران واکسینه تلقی و تفسیر می گردد.
• گاهگاهی ویروس هاری ممکنست از بزاق و بندرت از رسوب ادرار ویا مایع مغزی نخاعی جدا می گردد. جداسازی ویروس هاری غالبا در اوایل بیماری ، قبل از آشکارشدن پادتنهای خنثی کننده در سرم امکانپذیر بوده زیرا این  پادتنها، یک خاصیت اتواستریلیزاسیون بافتی دارند.
• آنتی ژن ویروس هاری ممکن است قبل از مرگ با تکنیک پادتن فلورسانت در برشهای فریز شده بافتی از بیوپسی های پوستی نشان داده شوند. چندین بیوپسی پوستی که حاوی فولیکولهای متعدد مو می باشند توسط رنگ آمیزی  پادتن فلورسنت رنگ آمیزی می شوند تا آنتی ژن ویروسی موجود در سلولهای اعصاب حسی ناحیه مذکور، تشخیص داده شوند. شناسایی آنتی ژن ویروسی، همچنین در گستره های تهیه شده از  تماس لام های شیشه ای با قرنیه چشم صورت می گیرد ولی حساسیت این روش نمونه گیری، پایین بوده و نتایج مثبت کاذب ممکنست ایجاد گردد.
• تشخیص RNA ویروس هاری: مقادیر کم RNA ویروس هاری از نمونه های بزاق، بافت مغزی ویا مایع مغزی نخاعی با استفاده از تکنیک­های مولکولی تکثیر و جداسازی می گردد. این تکنیک­ها، ابزار ارزشمند تشخیص هاری هستند که در ابتدا برای تایید هاری در نمونه های مایع مغزی نخاعی و متعاقبا برای تایید تشخیص هاری درنمونه های بزاق استفاده گردید.

نمونه بزاق برای آزمون Real Time PCR را میتوان توسط یک پی پت ظریف جمع کننده اشک چشم Eye dropper  جمع آوری نمود. احتمال تشخیص هاری توسط این تکنیک، با استفاده از نمونه های بزاق بیماران قبل از مرگ، بیشتر از نمونه های مایع مغزی نخاعی آنها می باشد. درمقایسه، چنین می توان نتیجه گیری نمود که حساسیت نمونه های بزاق با روش  100 درصد بوده ، البته بشرطی که حداقل 3 نمونه متوالی از بیمار گرفته شود و از نمونه های بزاق برای آزمون مولکولی  و از نمونه های بیوپسی پوست برای آزمایش تشخیص هاری به روش ایمونوفلورسانس میتوان استفاده نمود.

بایستی این نکته مهم را درنظر داشت که نتیجه منفی آزمون تشخیص آنتی ژن ویروس هاری و یا RNA ویروسی،  تشخیص بیماری را رد نمی کند چنانچه گمانه زنی های بالینی بیماری ، دال بروجود بیماری است، بایستی این آزمون ها مجددا تکرار گردند.

بافت مغزی: حضور اجسام نگری در نرون های مغزی، یک یافته آشکارو شاخص مشاهده شده در روشهای رنگ آمیزی بافتی روتین است ولی ممکن است این اجسام داخل سیتوپلاسمی در داخل سلولهای آلوده دیده نشوند. بافت مغزی پس از مرگ بیمار، توسط تکنیک آسپیراسیون سوزنی از درون حفره چشمی ویا سوراخ بزرگ پس­سری جهت انجام آزمون جداسازی ویروس هاری، شناسایی آنتی ژن ویروسی (توسط تکنیک ایمونوفلورسانس ویا رنگ آمیزی ایمونوپراکسیداز) ویا جداسازی RNA ویروسی صورت گیرد.

روش نمونه­ گیری مغز پس از مرگ

براي انجام اين كار مواد، وسايل و محلول­ هاي زير مورد نياز است:

• نمونه مغز بيمار فوت شده مشكوك به ابتلا به بيماري هاري: اين نمونه از متوفيان در بيمارستان ها و يا مراكز پزشكي قانوني تهيه مي گردد. نمونه مغز تهيه شده، پس از نمونه برداري طبق اين دستور العمل جهت تشخيص، به آزمايشگاه كشوري تشخيص هاري و مركز رفرانس WHO، انستيتو پاستور ايران ارسال مي گردد.

محلول ها و مواد شيميايي مورد استفاده:

• گليسرين 50 % در محلول PBS ( به ضميمه تهيه محلول گليسرين رجوع شود.)

وسايل مورد نياز:‌

• كيت ارسال نمونه هاري
• وسايل استاندارد كالبد گشايي شامل ماشين موتراشي، چاقو، اره، استخوان بر.
• رعايت تمامي نكات ايمني اعم از پوشيدن دستكش لاستيكس ضخيم مخصوص اتوپسي و عينك محافظ چشم ها به منظور ممانعت از آلودگي هنگام نمونه برداري ضروري است.
• فرم ارسال نمونه هاي مغزي مشكوك به هاري به شماره 63-LA-FO-004 تكميل و به همراه نمونه در بسته بندي جداگانه، به آزمايشگاه كشوري تشخيص هاري و مركز رفرانس  WHO ‌ارسال گردد.
• نمونه هاي مغزي را از بافت تازه مغز، بدون قرار دادن د رمحلول فيكساسيون از قبيل فرمالين تهيه كنيد.

به نمونه­ هاي مغزي،‌ نبايد هيچگونه مواد نگه­دارنده اضافه گردد.

1-1)در هنگام نمونه برداري نبايستي به نمونه ها آسيبي مانند له شدگي وارد گردد.

1-2)نمونه مغز تهيه شده بايستي به ابعاد 1*1*1 سانتي متر بوده و ترجيحا” آن را از ساقه مغز كه براي تشخيص مناسبتر است، تهيه كنيد.

1-8-1) از ساير بافت ها مانند مخچه، پونز، مدولا، هيپو كامپ و طناب نخاعي نيز مي توانيد نمونه برداري كنيد.

1-3)نمونه هاي تهيه شده را در محلول گليسرول 50% قرار دهيد( به ضميمه تهيه محلول گليسرين رجوع شود.)

1-4)نمونه هاي مغزي تهيه شده را در دماي2±4 درجه سانتي گراد نگهداري كنيد.

1-5)نمونه ها را بايد با حفظ زنجيره سرد و در دماي2±4 درجه سانتي گراد به آزمايشگاه كشوري و مركز رفرانس WHO مستقر در انستيتو پاستور ايران انتقال دهيد.

1-11-1) در صورت عدم ارسال سريع، نمونه ها را بايد در دماي 2±20- درجه سانتي گراد يا پايين تر نگهداري كنيد.

1-11-2) نمونه ها به هيچ عنوان حين انتقال نبايد باز شوند.

1-11-3) نمونه ها را حتي المقدور، بر روي يخ خشك در هنگام انتقال قرار دهيد.

1-6) نمونه ها را بايد در ظروف در بسته استريل شده و غير قابل نفوذ ارسال كنيد،‌ به طوريكه چيزي به آن وارد نشده و يا شيرابه نمونه از آن خارج نگردد.

بر روي نمونه ها حتما” آدرس كامل فرستنده و گيرنده، شماره تماس ثابت و همراه و همچنين عبارت ” نمونه انساني مشكوك به هاري ” قيد كنيد.

تشخیص­ های افتراقی

بیماری هاری بایستی از دیگر مواردانسفالیت حاد پیشرونده ، علی الرغم وجود سابقه مشخص مواجهه با موارد مشکوک ویا گزش توسط حیوان، تمایزداده شود. دراین ارتباط، انسفالیت های ناشی از آربوویروسها (انسفالیت ژاپنی، ویروس وست نایل[4])، انسفالیت ناشی از ویروس Nepah، آنتروویروس ها و ویروس هرپس، انسفالیت ناشی از پورفیری حادکبدی[5]، انسفالیت ناشی از سوء مصرف موادی نظیر الکل، سندرم حاد سروتونین، سندرم گیلن باره، عوارض ناشی از مصرف واکسن های هاری تهیه شده در نسج مغزی ، سکته های مغزی، سرع و توده های داخل مغزی را بایستی درنظر داشت.

علائم بالینی درفاز اولیه ممکنست با برخی از بیماریهای عفونی نظیربیماریهای غیراختصاصی ویروسی، مونونوکلئوزیس ، باکتریمی اولیه ویا مننژیت اشتباه شود. تشخیص افتراقی به این نکته بسیار وابسته خواهد بود که آیا بیمار فرم انسفالیتیک ویا فرم فلجی بیماری را ازخود نشان خواهد داد.

چنانچه بیمار، مجموعه ای از علائم ونشانه های انسفالیت را از خود نشان میدهد ، بایستی آن را از سایر بیماریهای عفونی رایج نظیر انسفالیت ناشی از ویروس هرپس سیمپلکس ویا ویروس وست نایل و نیز بیماریهای غیرعفونی دیگرنظیر واسکولیت سیستم اعصاب مرکزی و آنسفالوپاتی متابولیک و یا سمی متمایز نمود.  با تمام این تفسیرها، بیماری هاری را میتوان با علائمی نظیر ترس از آب (هیدروفوبی)، ترس از هوا (آئروفوبی)، اختلال دربلع، ضعف و سستی از انسفالیت های مذکور  افتراق نمود.

سایر علل سفتی عضلانی که در بیماری هاری نیز دیده شده و ممکن است اشتباه گردند عبارتند از: کزاز، اختلال در انقباض عضلانی ناشی از داروی فنوتیازین و مسمومیت با استریکنین می باشند.

بیمارانی که دچار هذیان می باشند نیز ممکن است علائم آژیتاسیون (رعشه)، لرزش و توهم رانیز ازخود نشان دهند، ولی با عدم بروز علائم هیدروفوبی و آئروفوبی از بیماری هاری متمایز می گردند.

فرم فلجی بیماری ممکنست با سندرم گیلن باره ، بیماری فلج اطفال (پولیومیلیت)، فلجی ناشی از ویروس وست نایل و میلیت (التهاب عصب) حاد اشتباه گردد. بیماران مبتلا به پولیومیلیت مشکل در اعصاب حسی نداشته و با شروع فلجی، معمولا تب نخواهند داشت.

از دیگر بیماریهایی که بایستی از بیماری هاری افتراق داد عبارتنداز: پلی نوروپاتی های حاد، بیماریهای ناشی از اتصال عصب-عضله و سایر فرآیند هایی که بروی طناب نخاعی تاثیرگذار می باشند

منابع

1. CDC site. http://www.cdc.gov/rabies/specific_groups/doctors/ante_mortem.html.
2. Jackson, A. C. “Rabies.” Handb Clin Neurol.
3. MacLachlan, N. J. and E. J. Dubovi, Eds. (2011). Fenner’s Veterinary Virology. USA, Academic Press.
4. Lyles D, Rupprecht C. Rhabdoviridae. Fields virology. 2007.

[1] CSF

[2] intra-vitam

[3] Shedding

[4] West Nile

[5] Acute hepatic porphyria